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　　微量離心管和細胞培養(yǎng)瓶可以高壓蒸汽滅菌嗎

　　微量離心管（EP管）離心管可以高壓滅菌。PP材料的離心管是可以高壓滅菌的。但不要擰的太緊，否則涼下來會變形。

　　細胞培養(yǎng)瓶滅菌方法

　　二、濕熱滅菌法 濕熱滅菌法是指利用高溫和高濕度對細胞培養(yǎng)瓶進行滅菌的方法。通常使用的設(shè)備是高壓滅菌鍋(也稱為高壓蒸汽滅菌器)。操作步驟如下:

　　將待滅菌的細胞培養(yǎng)瓶放置在高壓滅菌鍋中,注意瓶蓋朝下放置,以防止水分進入瓶內(nèi)。

　　加入適量的蒸餾水,使高壓滅菌鍋內(nèi)保持高濕度。

　　細胞培養(yǎng)的基本知識

　　操作前準備工作:

　　1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上;

　　2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上;

　　3.培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物.分裝后置-20度保存;

　　4.消化液(pH7.8)或其它加入液,應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存;

　　5.各種凍存的液體復溫時應邊搖邊融化,否則有的液體(特別是培養(yǎng)基)容易產(chǎn)生沉淀.

　　6.培養(yǎng)箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上,如有高溫滅菌的應按程序來菌).至少每月一次.

　　7.進入操作時應注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數(shù)量較多,培養(yǎng)瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,開開后應用燈先燒口,然后燒蓋.用完后同樣操作.整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點.

　　復蘇:

　　1.應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調(diào)至37-37.5度,取出凍存的細胞迅速放入后交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化.

　　2.在無菌臺內(nèi)將培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內(nèi),約5ml左右,然后用無菌吸管從凍存管內(nèi)取出細胞,置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃,使細胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

　　傳代:

　　1.貼壁細胞:

　　對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱.50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據(jù)配制強度經(jīng)驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘,鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?

　　2.懸浮細胞:

　　一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi),加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),如要高濃度可先離心500rpm,5min后加入培養(yǎng)基,輕輕吹勻后,分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

　　無菌操作

　　簡要介紹：1.將試驗用品放入超凈工作臺用紫外線照射30分鐘;2. 照射30分鐘后，進入緩沖間，換滅菌的無菌衣，換專用拖鞋;3.手部用5%的潔爾滅浸泡2分鐘，進入潔凈區(qū)后，用75%的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩;5.操作時盡量靠近火焰;6.裝培養(yǎng)基的瓶子等不要直接口向上，用一個架子斜放，瓶口朝向火焰;7.標準操作，不要讓無菌吸管到處碰來碰去;8.中途出入無菌室，再次操作時，一定要再次用75%的酒精棉球消毒。

　　一般來說，如果你培養(yǎng)的細胞是貼壁生長的話，去除舊的培養(yǎng)基后，不管是直接加入新鮮培養(yǎng)基吹打(細胞易脫落)，還是在胰酶消化后用新鮮培養(yǎng)基吹打，都可不用臺盼蘭染色，因為，死的細胞都掉落在舊培養(yǎng)基里，而活的細胞則貼在壁上。如果細胞是懸浮生長的，則需要用臺盼蘭染色。不要擔心計數(shù)不準，因為你可以將染色液的體積換算回去呀。比如0.1ml細胞懸液加0.1ml臺盼蘭，在EP管內(nèi)混勻后計數(shù)，計數(shù)完的細胞數(shù)×2不就還原了嗎。你在計數(shù)板中看到的亮點就是細胞，當細胞單個懸浮時，光的通透性就強一些，而細胞成片貼壁時，細胞就暗一些，是正常的。

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