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本生揭秘:多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題
更新時(shí)間:2023-04-23瀏覽:1135次

  本生揭秘:多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題


  多孔細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時(shí)同樣遵循嚴(yán)格無菌的原則,各項(xiàng)操作要保證規(guī)范、科學(xué),不對(duì)細(xì)胞的生長造成額外的影響。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。

  多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的加樣和操作:

  細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時(shí)同樣遵循嚴(yán)格無菌的原則,各項(xiàng)操作要保證規(guī)范、科學(xué),不對(duì)細(xì)胞的生長造成額外的影響。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。


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  問:

  96,24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松,這樣是方便了透氣,但是細(xì)菌、霉菌等污染物會(huì)不會(huì)也隨著溜進(jìn)去呢?

  答:

  蓋子很松,屬于半開放培養(yǎng),這樣的目的是透氣(實(shí)際上是為了使培養(yǎng)皿外的CO2能夠與培養(yǎng)皿充分交換,維持培養(yǎng)基的pH值)。

  凡事有利必有弊,這樣當(dāng)然增加了污染的可能性。此外這樣還會(huì)使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā),這對(duì)于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔(定期紫外線照,酒精擦洗,盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱)b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%(培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的水槽)。

  就好像培養(yǎng)皿,也是一個(gè)蓋倒扣的容器,也不會(huì)污染。主要是因?yàn)樯w子“L"型邊緣產(chǎn)生氣流負(fù)壓的緣故,灰塵上面才附著有微生物,而氣流攜帶的灰塵是無法通過產(chǎn)生負(fù)壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴(kuò)散,不會(huì)產(chǎn)生氣流,所以只會(huì)透氣不會(huì)透菌。

  問:

  使用24孔板,在其中的某些孔中有操作(在超凈臺(tái)內(nèi)),而其他孔中還有細(xì)胞要培養(yǎng).我很擔(dān)心這樣會(huì)污染,不知道要注意什么?

  答:

  在超凈臺(tái)內(nèi)如果操作規(guī)范的話應(yīng)該可以的,我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子,盡量只暴露要操作的孔,將其他孔用蓋子蓋起來。

  使用前綜合考慮一下,充分使用所有的孔;如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的,其余用蓋子蓋住,我習(xí)慣于先用右側(cè)的孔(右手加樣方便)。


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  操作時(shí)用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高,不要把蓋子全打開,一般沒問題。

  細(xì)胞分布不均及解決辦法

  問:

  細(xì)胞接種培養(yǎng)板,細(xì)胞總是聚集在周邊部分,該如何處理啊?

  答:

  請(qǐng)問你的細(xì)胞是如何混勻的?是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板?如果是后者,而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話,很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分,導(dǎo)致細(xì)胞中間少,四周多!

  這里提供一個(gè)好辦法:在培養(yǎng)種板之前,把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的飽和后再取出,種入細(xì)胞時(shí)力量要輕,可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細(xì)胞懸液流入板孔中,培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長。記住千萬不要用振蕩器振蕩,否則你的細(xì)胞就會(huì)想你說得那樣聚積在一起。

  培養(yǎng)板孔直徑愈小,這個(gè)現(xiàn)象越明顯,24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免,因?yàn)橐后w的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是成一個(gè)液平面,而是周邊高,就像凹鏡一樣,而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液,使得細(xì)胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集"現(xiàn)象,如果為了使孔中央也有均勻細(xì)胞而增加接種細(xì)胞數(shù)量的話,這要看你需要觀察何種指標(biāo),如果是MTT,免疫組化的話會(huì)因?yàn)榧?xì)胞成層而影響結(jié)果。

  消化細(xì)胞時(shí)要注意吹打均勻,避免細(xì)胞成團(tuán),而且孔內(nèi)培養(yǎng)液量要足夠,一般接種時(shí)加足量培養(yǎng)液,加干預(yù)時(shí)換一次液,干預(yù)液加培養(yǎng)液量等于接種時(shí)培養(yǎng)液量,這樣的話“邊集"現(xiàn)象會(huì)有所改觀,不妨一試。

  問:

  我做的是空斑形成實(shí)驗(yàn),最好是細(xì)胞鋪成均勻的一層,,可接種病毒時(shí)大部分孔都還好,個(gè)別的不太均勻。細(xì)胞組內(nèi)差異很大,想請(qǐng)教一下大家加細(xì)胞的時(shí)候都有什么方法呀?

  答:

  細(xì)胞消化后吹打成單細(xì)胞懸液很關(guān)鍵!保證分板時(shí)每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)目是一致的!

  當(dāng)然還有處理因素各個(gè)孔之間的平行也很重要,比如說加藥時(shí),藥物稀釋后混勻,保證每個(gè)孔的濃度是一致的!

  再者加細(xì)胞和藥物時(shí),要試驗(yàn)組和對(duì)照組一塊輪流加,避免加樣先后順序?qū)е录?xì)胞密度和藥物濃度的差異!

  問:

  吹打已經(jīng)是均勻了,但是鋪板,6孔,24孔總有些不均勻,有點(diǎn)往中間集中。而且明明計(jì)數(shù)好了鋪,長一兩天,各個(gè)孔密度又不一樣,對(duì)檢測(cè)有影響,有良策嗎?

  答:

  如果用巴氏吸管鋪的話,每次吸取的量不要太多,因?yàn)槲軆?nèi)的細(xì)胞會(huì)自動(dòng)向下沉,往往第一開始幾個(gè)孔細(xì)胞數(shù)多,經(jīng)常均勻細(xì)胞懸液,加液走S型路線。

  如果用移液器的話,tips要處理下,把去掉避免損傷細(xì)胞,這樣每一次取液對(duì)應(yīng)一個(gè)孔。用tip一對(duì)一孔加入比較準(zhǔn)確。但也要注意混勻懸液。

  設(shè)立平行組,n要足夠大(可以計(jì)算一下)。

  鋪板后不要搖,因?yàn)閾u動(dòng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞向中間聚集。最好鋪板一次搞定。

  多孔細(xì)胞培養(yǎng)板 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。


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