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如何科學(xué)正確地使用凍存管呢?
更新時間:2020-11-23瀏覽:3740次

  如何科學(xué)正確地使用凍存管呢?

  凍存管的使用是一門學(xué)問,并不是打開液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡單的三部曲可以完成的。科學(xué)正確地使用凍存管,可以避免樣本的損失,并保護試驗人員的安全。

  凍存管有IATA航空運輸協(xié)會標準測試證書,常規(guī)儲存細胞培養(yǎng)物,組織樣品,微生物樣品(如病毒,細菌,酵母,真菌,孢子等),人源或動物源其它生物樣品(如血液,血清,精液,抗體,RNA, DNA和蛋白樣本),不適合存儲再生醫(yī)學(xué)樣本。

  冷凍步驟:

  用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細胞,吸取溶液,含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細胞(薄薄的液層足夠,胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細胞系確定)。

  37℃孵育細胞3-5分鐘。

  細胞從底部脫離之后,終止孵育,加入含有血清的培養(yǎng)基,用移液器輕輕地懸浮細胞。

  離心細胞懸液(500 x g, 5分鐘),用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

  細胞計數(shù)。

  離心細胞懸液(500 x g, 5分鐘),去除上清液,用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

  以1:1體積比混合細胞和凍存液(60%培養(yǎng)基,20%胎牛血清,20% DMSO),然后轉(zhuǎn)移到凍存管中。凍存的細胞密度為 1-5×106 個/毫升。

  含有細胞的凍存管建議以−1 K / min 的速率降溫,可以將凍存管置于−70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲其他樣品,可以直接放置在−20℃,−70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻,4 mL和5 mL的凍存管需要先置于在−20℃冰箱過夜,然后再轉(zhuǎn)移到−70℃或者液氮的氣相。

  然后轉(zhuǎn)移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮,請將凍存管置于液氮的氣相,切勿置于液相。

  解凍步驟:

  從液氮罐取出凍存的細胞后立即置于37℃水浴搖晃Cryo.sTM凍存管1-2分鐘。解凍過程需要越快越好。

  轉(zhuǎn)移解凍的細胞于15 mL離心管,立即用大量的含有血清的細胞培養(yǎng)基混勻。

  500 x g離心細胞5 分鐘,去除上清液,用適量的含有血清的細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞,然后轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶。

  按照建議的細胞濃度接種。

  接下來的12小時細胞進入靜默期。

  間隔24小時和48小時更換培養(yǎng)基

  如果細胞感染了病毒,也可以參考以上步驟進行冷凍存儲和解凍的操作。

  凍存管安全操作建議

  凍存管用來存儲樣品,只能置于液氮氣相或冰箱。禁止凍存管浸沒于液氮液相,否則液氮可能滲入凍存管。因此,解凍時,蒸發(fā)的液氮產(chǎn)生高壓力,終導(dǎo)致凍存管炸裂,并且還將導(dǎo)致感染物質(zhì)釋放。

  因此,操作凍存管時需要佩戴合適的個人安全防護措施,如穿戴安全護服、佩戴護目鏡、在安全櫥操作。

  進行冷凍保存時,凍存管需要緩慢地降溫至冷凍溫度。如果不是緩慢地降溫到冷凍溫度,將導(dǎo)致冰塞形成(如在凍存管頂部),冰塞將阻礙液體形成凝固,將導(dǎo)致高壓力危險和后續(xù)的爆管風(fēng)險。

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